流式多色分析中探花 姐妹花，抗体不良鸠合、染料间的荧光溢漏以及样本自觉荧光等多种成分可导致非象征细胞的配景信号擢升，为阳性细胞类群的准确圈门带来诸多挑战。合理使用对照样本不错匡助流式操作家更长远地评估不同开始配景信号对流式检测的影响，在提拔圈门的同期为践诺决策改善提供带领。常见的对照包括同型对照（Isotype Control）、荧光减一双照（FMO Control）、生物学对照（Biological Comparison Control）等。本期著述将和全国磋商各样型对照开荒的方针与局限性，硬核流式操作指南，给你班班可考的流式操作手段。

同型对照（Isotype Control）

同型对照是使用与指标荧光抗体同种类型（包括疏导种属开始、亚型、剂量、荧光象征及疏导免疫球卵白）的荧光一抗染色对照样本，连系东说念主员但愿通过同型对照评估抗体不良鸠合对配景信号的搅扰1。

近十几年来，东说念主们在同型对照的使用中充满争议，以为同型对照对于提拔圈门不具带领兴味。充分理会荧光抗体不良鸠合的机制将有助于揭示同型对照的局限性。图1回归了抗体不良鸠合的多种类型，其中包括抗体对非指标抗原表位的低亲和非特异鸠合（图1.A-C）；染料分子扞拒原的非特异性吸附（图1. D-F）以及抗体与非指标抗原表位的特异性鸠合（图1. G-I），如Fc受体（CD16、CD32、CD64及CD89）扞拒体Fc端的鸠合（图1.H）。

图1. 抗体不良鸠合包含多种类型，

仅靠同型对照无法秘密沿途

显着，同型对照无法秘密扫数抗体不良鸠合所带来的影响，但可在一定进度响应抗体非特异吸附与Fc端特异性鸠合的进度。此外，同型对照对于同型抗体的条款又是极为无情的，不同坐蓐工艺下染料/抗体比例的不同会带来抗体非特异鸠合的各异，不同免疫球卵白也可导致同型对照染色配景的显耀区别（图2）。接收与指标抗体同厂家的同型抗体不错减少坐蓐工艺带来的系统缺陷。

图2. 不同种类的同型抗体可带来各异化配景信号

由于理念念的同型抗体难以赢得以及要津学适度成分，限制内科学家对于同型对照所达成的共鸣是，同型对照无法单独四肢多色践诺中的圈门依据，仅在某些突出环境下（如新采购抗体的特异性评估评等）可用于定性分析。1，2，3对于非特异吸附与Fc端鸠合所带来的配景信号擢升，更好的处罚决策是通过抗体滴定及Fc Block等缩小影响。

荧光减一双照（FMO Control）

荧光减一（Fluorescence Minus One， FMO）对照是指多色践诺中仅不染色指标荧光抗体的对照样本，常用于评估多色决策中指标通说念受其余染料的荧光溢漏搅扰。文件中大批以为在高维流式分析中，比拟于抗体非特异吸附，配景信号主要来自于荧光溢漏所产生的扩散缺陷（Spread Error），因此比拟于同型对照，FMO对照被以为是多色践诺中更蹙迫的门控对照。4，5

图3. 高维流式分析中，

更推选使用FMO对照提拔圈门

同期，在多色流式中，FMO对照也常用于判定决策中同样染料的相互影响。如在OMIP-69全光谱流式40色染色决策中，连系东说念主员使用FMO对照阐发了FITC与BB515两种光谱同样染料在兼并染色决策中共用的可行性（图4）。6

图4. 使用FMO对照评估光谱同样染料搅扰情况

对于进步20色的染色决策，出于对样本总量和践诺经济性的考量，有文件报说念可将FMO对照彭胀为Fluorescence Minus Multiple（FMM）提高践诺后果。图5所示的25色全光谱流式分析决策中，连系东说念主员仅通过3组FMM便完成了19中荧光抗体的对照开荒。7

图5. 将FMO彭胀为FMM可提高践诺后果

除荧光溢漏评估外，FMO对照也被报说念用于染色过程的优化。举例一项对于趋化因子受体染色决策优化的连系中，连系东说念主员奥秘地期骗FMO对照发现一次性加入CCR5、CX3CR1、CCR2抗体可导致空间位阻效应引起的染色不及，FMO-CCR5染色组的CCR2染色后果大幅擢升，从而为分批次染色的过程的优化提供了表面基础。8

图6. FMO对照可用于染色过程优化

生物学对照

(Biological Comparison Control）

生物学对照对于特定秀美物的准确圈门具有极其蹙迫的价值。举例在细胞刺激践诺中，未刺激对照样本包含了扫数荧光抗体可提供FMO和同型对照所包含的荧光溢漏、非特异性吸附信息，与践诺组的区别仅为样本刺激。因此未刺激对照可四肢理念念的阴性群体提拔圈门。在非刺激践诺中，已经需要通过生物学对照对践诺表象进行合理会释，举例任何疾病现象与健康个体之间的表性对比，其蹙迫性不言而谕。

总  结

包括流式在内的任何分析践诺中，对照样本对于践诺论断的合理会释王人是至关蹙迫的。本期流式硬核操作指南通过综述多篇经典连系论文，磋商了流式分析中常见对照开荒的方针与局限性，以及当今限制内对于几种对照样本的主流不雅点。接待全国阅读参考文件原文，获取更冷静流式对照硬核信息。

往期硬核流式操作指南

>>> 荧光抵偿，怎样调更可靠？

>>> 抗体滴定，看似繁琐但很必要

参考文件：

1.Hulspas R， O'Gorman MR， Wood BL， Gratama JW， Sutherland DR. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 2009. doi: 10.1002/cyto.b.20485. 

2.O'Gorman M ，  Mcnally A C ，  Anderson D C ， et al. A Rapid Whole Blood Lysis Technique for the Diagnosis of Moderate or Severe Leukocyte Adhesion Deficiency. Ann N Y Acad. 2010. doi: 10.1111/j.1749-6632.1993.tb38807.x

3.Hammerbeck C， Goetz C， Bonnevier J . Primary and Secondary Antibodies and Flow Cytometry Controls. 2018. 

4.Staats J， Divekar A， Mccoy J P， et al. Guidelines for Gating Flow Cytometry Data for Immunological Assays. 2019.

5.Maecker HT， Trotter J. Flow cytometry controls， instrument setup， and the determination of positivity. Cytometry A. 2006. doi: 10.1002/cyto.a.20333

6.Park LM， Lannigan J， Jaimes MC. OMIP-069: Forty-Color Full Spectrum Flow Cytometry Panel for Deep Immunophenotyping of Major Cell Subsets in Human Peripheral Blood. Cytometry A. 2020. doi: 10.1002/cyto.a.24213. 

7.Jensen H A， Wnek R. Analytical performance of a 25‐marker spectral cytometry immune monitoring assay in peripheral blood. Cytometry Part A.2020. doi: 10.1002/cyto.a.24290

8.Jalbert E， Shikuma CM， Ndhlovu LC， Barbour JD. Sequential staining improves detection of CCR2 and CX3CR1 on monocytes when simultaneously evaluating CCR5 by multicolor flow cytometry. Cytometry A. 2013. doi: 10.1002/cyto.a.22257

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