列位同仁，为保证咱们的分析成果，延迟色谱柱的使用寿命，民众整个来孝敬一下我方在色谱柱使用经过中的护柱诀要吧。我先来聊聊，算是投砾引珠了1、最好用预柱。（但要紧密，若有时出峰非常，要先望望是不是它有问题了）2、每次作念完分析，王人要进行冲洗， 分析用流动相中若无酸、碱、盐类物资，提出用90％甲醇冲洗30～60min； 若分析用流动相中含以上物资，要先用10％甲醇（或用与分析用流动疏导比例，把含酸、碱、盐溶液换成水）冲洗1小时傍边，再梯度走到90％甲醇冲洗30～60min（若用多元泵）。有必要时再轮回几次，不错合乎镌汰期间。 若永劫间毋庸该色谱柱，要冲洗好后，用纯甲醇或乙腈封存。3、若流动相顶用到离子对试剂，更应该好好冲洗，且该色谱柱最好当作专用，不成再作念其它物资分析用。因色谱柱填料性质已与正本所不同，在该柱上所摸索的色谱条目，可能在其它同类柱子上得不到重现。4、尽量幸免反冲，除非该色谱柱厂家明确说明允许。5、普通C18柱尽量幸免在40℃以上的温度下分析。6、依期测柱效，有下落，不错用10％异丙醇甲醇冲洗色谱柱。若柱效还莫得改善，不错再生，甲醇－二氯甲烷－甲醇。呵呵，还有的一时思不起来了，列位有教学的战友请发表远瞩！1．样品要罗致0.22或0.45μm滤膜过滤，流动相罗致0.45μm滤膜过滤并脱气。 2．大多数反相色谱柱的pH结识边界是2－7.5，尽量不逾越该色谱柱的pH边界3．幸免流动相构成及极性的剧烈变化。4. 幸免纯水冲洗反相色谱柱。5．每次测试结束，要用20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱（分析色谱柱250×4.6mm柱体积3.2ml）。如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验结束后将柱子用纯水冲洗干净，并保存于乙腈中。 6．压力升高是需要更换预柱的信号。helen_gu wrote:1．样品要罗致0.22或0.45μm滤膜过滤，流动相罗致0.45μm滤膜过滤并脱气。 2．大多数反相色谱柱的pH结识边界是2－7.5，尽量不逾越该色谱柱的pH边界3．幸免流动相构成及极性的剧烈变化。4. 幸免纯水冲洗反相色谱柱。5．每次测试结束，要用20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱（分析色谱柱250×4.6mm柱体积3.2ml）。如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验结束后将柱子用纯水冲洗干净，并保存于乙腈中。 6．压力升高是需要更换预柱的信号。幸免流动相构成及极性的剧烈变化。是不是流动相构成改换时要有个梯度，沉着升或沉着降?那要多慢呢，比如说我用水和乙腈作念流动相，思从20:80升至100:0，设定多永劫间比较合适呢另外，纯水冲反相柱的纰谬是什么呀?请多见教，谢谢了说说防卫色谱柱堵塞的问题吧：1：溶剂中的不溶物—应使用色谱纯溶剂，膜过滤（孔径不逾越0.45μm）2：样品中的不溶物—交代样品进行膜过滤（孔径不逾越0.45μm）3：泵，进样器等中的不溶物—在泵和进样器之间安装内置过滤器，在进样器和柱之间安装预过滤器4：柱内不溶物的形成：由于溶剂的不互溶而产生的千里淀—用能溶解千里淀物的溶剂冲洗色谱柱；在不互溶溶剂中由于进样而产生的千里淀—检讨样品液和流动相是否互溶；由于温度的改换或固定相的干涸而产生的千里淀—将色谱柱密封紧，并保持室温恒定！还有等于均衡色谱柱、色谱柱的再生：1 均衡色谱柱：反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或输送经过中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈均衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应紧密用纯水"过渡"。　　硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用酒精或异丙醇均衡 怎样均衡色谱柱？ 　　均衡经过中，将流速沉着地晋升；用流动相均衡色谱柱直到获取结识的基线（缓冲盐或离子对试剂浓度如果较低，则需要较长的期间来均衡）2 色谱柱的再生：进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。0.05M稀硫酸不错用来清洗已羞耻的色谱柱！偶也来参与一下，谈一丝管见1.对于一些特殊型号的柱子，举例不同型号的手性柱应严格按照柱子的相应说明书所要求的进行爱戴，并按照其规则的边界遴荐试剂的种类，比例，PH ，等等；2.尽量幸免柱子进气泡的气候出现，如在实验 经过中提神流动相的体积，同期对所需体积进行大要的揣度，以免吸空，气泡进柱，尽管有多种排气泡的方法，但毕竟影响柱子的性能，尤其是比较“娇贵”的柱子；每天用饱胀的期间来均衡色谱柱，您就会在惩办问题方面获取最大的"赔偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得作念！ 　　新的色谱柱在使用之前应该在您我方的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的历练陈诉上测试条目和样品来测定该色谱柱的柱效。况且，在以后的使用中，适时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片镶嵌柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架进取推，直至高过夹套片 4．将卡套帽和卡套架旋在整个，然后用手拧紧 5．然后依相同的纪律一语气好柱子的另一端 6．一语气到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 紧密：使用卡套柱时，两头的卡套适时刻一语气在柱芯上。不管您是均衡色谱柱或是清洗，任何时候王人不成将卡套取下来，否则会形成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片镶嵌柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架进取推，直至高过夹套片 4．将"枪弹头"预柱放入卡套片内 5．将卡套帽和卡套架旋在整个，然后用手拧紧 6．然后依相同的纪律一语气好柱子的另一端 7．一语气到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同期不错修补色谱柱） 紧密：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补用具的头部也应该蘸取少许的甲醇/乙腈，以幸免在取出滤网和玻璃棉滤顷然带出柱子内的填料。 1．将修补用具中的2套入柱芯的尖端 2．将修补用具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针地方旋转到旋紧 3．一手抓柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯尖端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网底下的玻璃棉以及被羞耻的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补用具中的4将玻璃棉压入柱芯尖端 7．柱芯尖端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边际压平 均衡色谱柱 　反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或输送经过中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈均衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应紧密用纯水"过渡"。 　　硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用酒精或异丙醇均衡 怎样均衡色谱柱？ 　　均衡经过中，将流速沉着地晋升 　　用流动相均衡色谱柱直到获取结识的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的期间来均衡） 色谱柱的再生 　　进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，咱们提出最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。 表1　提出用来冲洗的溶剂体积 色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积 125-4 1.6ml 30ml 250-4 3.2ml 60ml 250-10 -20ml 400ml 请字据下表遴荐您的再生方法： 极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生： 正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→酒精→水** 非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生： 水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水 0.05M稀硫酸不错用来清洗已羞耻的色谱柱 紧密： 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的风物存在拳交 twitter，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗拳交 twitter，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。 **如果简便的有机溶剂/水的惩办不成够完全洗去硅胶名义吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗至极灵验。 色谱柱的爱戴 1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度） 2．大多数反相色谱柱的pH结识边界是2－7.5，尽量不逾越该色谱柱的pH边界3．幸免流动相构成及极性的剧烈变化 4．流动相使用前必须经脱气和过滤惩办5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验结束柱子冲洗干净，并保存大乙腈中6．压力升高是需要更换预柱的信号对于高效液相色谱柱的保护我也来谈谈吧。1.着手，溶剂、样品要前惩办，溶剂要用色谱级别的并用0.45um的滤膜过滤并脱气，样品要用0.22um的滤膜过滤。2.作念样前，柱子要均衡一段期间，先用甲醇均衡30-60分钟，再用纯化水均衡30-60分钟，然后用流动相均衡，直到基线走平时，再进样。3.作念样扫尾后，柱子要用甲醇和水冲洗，冲洗纪律与2步相背，临了柱子用甲醇（95%）保存。4.如果柱子里东西太多，不错用甲醇，乙腈，水反复冲洗。谈谈对于启用新柱子(C18)的紧密事项:1、着手应检讨一下，看是否为原装家具和外不雅完好意思情况。2、保存好供应商随柱提供的“对于柱性能测试陈诉”，其中包含了新柱子的最好性能成见，如在某预定色谱条目下的柱压、柱效等。3、重现流动相条目，主要不雅察柱压的变化（100%甲醇、100%乙腈、50%甲醇-50%水等），并将数据记载在“性能陈诉上”，以便今后对照。4、启用新柱子时的流动相流速应慢一丝，如0.3-0.5ml/min，经过10-15min后不错加速。5、对于25cm柱子，流速一般不逾越1.0ml/min，能用慢速流量时尽量使用慢一丝，诚然要接头分离成果和分析期间。加预柱喽！以上民众王人说了好多柱子保护方面的内容，还是很全了，但我思补充一个方面:用离子对色谱法时柱子使用的一个问题.咱们知说念，一般咱们分析样品时，常罗致有机相(甲醇，乙腈)-水体系当作流动相，对于大部分的分析责任，这个体系就能胜任了，但是，当咱们际遇弱酸碱时，比如生物碱，容易拖尾，这时候咱们不错罗致离子对色谱法进行分离，常用的离子对试剂有庚烷磺酸肭和十二烷基磺酸钠，这时候，咱们常罗致pH3-5的缓冲盐体系，咱们在 罗致离子对色谱进行分离时，该何如保护色谱柱呢?一个很首要的问题是，当咱们冲柱子的时候，应该先罗致有机相-水体系冲，再用水冲，然后用有机相冲，比如咱们的流动思是甲醇-0.5%的庚烷磺酸钠(pH3.3)(50:50)，咱们在冲柱子的时候，应该先用50%的甲醇水冲柱子，然后用水冲，然后用甲醇冲，这是为什么呢?咱们知说念，往时的洗衣粉的主要灵验要素是十二烷基硫酸钠(名义活性剂)，它不错把一些脂肪油洗下来(烷烃过甚繁衍物)，庚烷磺酸纳亦然名义活性剂，如果先用水冲洗，会产生用洗衣粉洗衣裳时的成果(ODS的固定相是长链烷烃)，会形成固定相的亏蚀，如果咱们罗致有机相-水体系先冲柱子，由于名义活性剂在有机相中有一定的溶解度，况且流动相的量比较大(相对于固定相，因为流动相是在不时的流动嘛)会使名义活性剂渐渐溶解在流动相中而被冲出，当名义活性剂被冲干净之侯，咱们就不错采吊水冲，然后罗致有机相保存柱子了.我也说说色谱柱的保护着手要看明晰说明书，是属于何种色谱柱，楼上列位所说王人是蚁合在反相柱上，而正相色谱柱的保护和惩办则有很大不同其次，色谱柱优致密坏的成见有柱效、柱压等如果在实验的某一天倏得发现柱压升高，或者峰形脱尾等气候，则有必要对色谱柱进行惩办。惩办方法，反相柱楼上的还是说了好多第三，色谱柱在进样时一定要过滤，最好加上预柱再附上一篇英文的色谱柱保护方法 colcare.pdf (100.25k)咱们的液相，既莫得在线流动相过滤器，也莫得预柱，（可能是经济原因不给配），是以，作念样王人要万分堤防，但是，柱压照旧会无语其妙的升高。从着手的100%甲醇600psi渐渐到临了1800psi，这个时候可能等于柱子堵了，但是出峰期间和柱效（踏板数）险些莫得什么变化。一般情况咱们的惩办办法是，将柱子用甲醇饱和后，将柱子竖直放手，进口端的地方竖直进取，用两个扳手渐渐将柱子的进口端螺丝拧下，这时，会看到白白的硅胶，有时候会看见一个薄薄的筛板，将拧下的螺丝和筛板进行超声清洗，螺丝只需用100%甲醇或者100%酒精和水超声即可，筛板需要先用水，再用20%硝酸（15分钟以上），再用异丙醇超声，其他的超声10分钟傍边就行。如果筛板和螺丝是一体的，那么就不成用那么高浓度的硝酸了5%既可了。启齿的硅胶在空气中放手1个小时以内是莫得任何筹商的，当超声结束后，按照正本的时势重新安装上就不错了。然后再用甲醇饱和。我的长柱子25cm和短柱子15cm的我王人绝交清洗过筛板，成果至极昭彰，压力从2200psi（25cm）下落至900psi，1800psi（15cm）下落至700psi。经过全部检讨细则压力增大是由柱子引起的不错一试。本东说念主鄙人，看了楼上列位的远瞩!也果敢在这里谈谈我方的一些管见!望列位多多见教!往时咱们使用得较多的柱子王人是反相柱，是以在这里我就只谈反相硅胶柱的一些清洗方法:清洗硅胶键合柱子 再生被羞耻HPLC柱子的重要是知说念羞耻物的性质况且能找到合乎的溶剂来回除。如果羞耻是因为重迭进样时强保留物资的积贮引起的，行使简便的设施来除掉这些羞耻物时时能复兴其色谱行动。有时候，经过屡次操作以后的色谱柱用90～100％的溶剂B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积不错清除羞耻物。（表2列举了不同规格的HPLC柱子的空体积，因此读者能便捷地细则相应柱子冲洗的体积。）举例，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。如果你使用的是缓冲液系统，不要平直切换到强溶剂，倏得转念到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液千里淀，这么会导致更大的问题如柱头堵塞、管说念堵塞、泵泄漏、活塞挫伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水）。冲洗5～10个体积以后才更换强溶剂。 有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的羞耻物洗掉。那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子乐，如果羞耻物瑕瑜生物物资，使用者不错跳过一个或多个另外的有机溶剂去除羞耻物。溶剂与溶剂之间的组合有好多。到柱子厂家的网页上能找到推选的溶剂系统。 一般来说，总共的清洗方法王人有雷同的风物。所用的溶剂王人是随溶剂强度加多，时常临了一个溶剂瑕瑜常疏水的（如醋酸乙酯以至是烃），不错用来溶解非极性物资如脂质和油类。咱们必须保证一系列溶剂中每个溶剂王人能与下一个溶剂互混。清洗经过要扫尾时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。举例，异丙醇是一个至极好的当作中间设施的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度至极大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。诚然，如果使用紫外检测器的话，幸免溶剂在紫外区域有招揽，要否则需使用大王人的溶剂冲洗才气使基线安详。 对于典型的硅胶键合柱来说如果莫得缓冲溶液的话推选使用以下溶剂系列： 100％甲醇 100％乙晴 75％乙晴－25％异丙醇 100％异丙醇 100％二氯甲烷 100％正己烷 用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才气用正本的水相溶剂。每种溶剂至少冲洗10个柱体积。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，分析者不错用1～2ml/min的流速来冲洗，要回还正本的溶剂体系，不需要每一步王人冲洗，不错跳过中间设施。中间设施推选使用异丙醇，然后用莫得缓冲的流动相，临了回复肇始流动相当置。四氢呋喃是另外一种比较受迎接的去除羞耻的溶剂。如果使用者怀疑柱子被严重羞耻，不错二甲基亚砜（DMSO）或者二甲基甲酰铵和水按50：50的比例羼杂用低于0.5ml/min的流速流过色谱柱。奏效再生反相柱子是一个至极耗期间的经过，溶剂冲洗不错行使梯度系统过夜操作。还有一个问题是清洗经过中是否不错把HPLC柱子反过来。因为大多数强保留的羞耻物王人会积贮在柱头，把柱子反过来不错镌汰羞耻物被冲出柱子的迁徙距离。接头到装填柱子的结识性，当今大多数HPLC柱子王人是比普通操作压力大好多的高压装填的，因此他们的柱床应该不会受到反地方流速的影响。但是，如果头上的烧结比尾部的烧结孔径大的话。举例尾部烧结的孔径是2μm，他往时能够留下平均5μm孔径里的填料。有时侯厂家会让头部孔径较大以幸免样品或流动相颗粒堵塞。如果这种孔径大于装填颗粒尺寸漫衍弧线的最小粒径时，有些填料能穿过这些漏洞而流出色谱柱，这么会导致空缺出现。如果柱子有箭头标记提出的流动地方，我提出通过操作手册和说明书，厂家主页或者技巧撑持部门等证据是否不错把柱子反过来冲。不管你是否把柱子反地方，最好不要让溶剂通过检测器幸免羞耻物和穿透漏洞的颗粒参加检测池，否则有可能引起羞耻。 清洗柱子频率主要看有些许强保留物资被打入色谱柱。因为反相柱有时候在辨认率清除或者鬼峰出现前能承受很大的羞耻，使用者时常会比及出现了非常情况才运转紧密。然而，羞耻物过多的积贮会导致清洗柱子的难度加大。是以，如果你知说念时常用杂质较多的样品上样时，我提出你们有国法地清洗柱子，你越是频繁清洗柱子，就清洗起来就越不汉典。我以为应该将总共紧密事项条例化，这么比较简明，底下是我的个东说念主不雅点：1. 罗致预柱或保护柱2. 要紧密样品的前惩办，如果是脏样品，举例中药提真金不怕火液，体液等，就需要罗致萃取等操作除掉对柱子损坏较大的杂质，举例色素、多糖、卵白质等3. 用0.45um的膜过滤流动相和样品4. 确保流动相pH在2~8之间5. 在用含缓冲液或者酸性较强的流动相时，分析完后要用水冲洗，再用纯有机溶剂（最好是乙腈）冲洗6. 防卫柱子干瘪，幸免色谱柱受到猛烈轰动7. 依期对色谱柱进行清洗，吸取残留的杂质，并对柱效进行测定8. 对每种样品最好罗致专用色谱柱9. 幸免倏得改换流速，也等于流速的改换要沉着流动相每天的需要很大的，王人用0.45um的膜不是很慢而且不经济啊我的流动相是甲醇和水按2比3的比例羼杂的，运转几天每天作念完后王人是先用双蒸水先冲30min，然后用甲醇冲30min，接着就保存在甲醇里到第二天再作念.柱子是新的ODS碳18柱子，今纯真挚告诉我不要冲太久，否则会把固定相上头的固定液冲走损害柱子，因为莫得加其他盐类，是以不错不冲太就王人不错了，那我何如清洗柱子呢hu_2104411 wrote:我的流动相是甲醇和水按2比3的比例羼杂的，运转几天每天作念完后王人是先用双蒸水先冲30min，然后用甲醇冲30min，接着就保存在甲醇里到第二天再作念.柱子是新的ODS碳18柱子，今纯真挚告诉我不要冲太久，否则会把固定相上头的固定液冲走损害柱子，因为莫得加其他盐类，是以不错不冲太就王人不错了，那我何如清洗柱子呢平直用甲醇冲洗。hu_2104411 wrote:流动相每天的需要很大的，王人用0.45um的膜不是很慢而且不经济啊那并不是不经济，因为膜照旧很低廉的，而一根柱子的价钱然则2000~3000元，如果是一些特殊的柱子，就更贵了，举例灌输色谱、高效排阻色谱柱、手性分离柱等，是以照旧不要怕吃力，这么会予以后的实验带来很大的刚正。1、 紧密正确地使用和存放色谱柱，不锈钢柱色谱柱可选用以下的溶剂保存：正相柱用烃类溶剂，反相柱用甲醇，离子交换柱用水或甲醇/水。某些专用分析色谱柱要紧密制造商规则的保存条目。另外，要紧密溶液的PH值，一般适度在PH2－8边界内，其硅胶柱PH＞8时会发生硅胶溶脱的情况，键合型柱PH＜2时会发生键合相断裂。2、 色谱柱羞耻后可罗致合适的溶剂冲洗，使柱效再生。⑴硅胶柱不错使用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、酒精和水按纪律冲洗色谱柱，经过净化的色谱柱必须进行水活化，即按上述相背的纪律冲洗。柱再生时所需要的有机溶剂要严格进行脱水惩办。⑵反相柱不错用甲醇、氯仿、正庚烷冲洗，键合C18柱一般用甲醇冲洗，必要时可用0.5 M EDTA钠盐溶液冲洗，然后用水冲洗，以达到去除柱内盐类。⑶键合型的离子交换柱不错用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。3、 对羞耻严重的色谱柱在冲洗无效时，需将柱内填料取出进行惩办或更换新的填料，还不错用更换柱头填料的方法行将柱头进口处的被羞耻的填料取出，重新补装和柱内同类型的填料，然后在改换柱流向进行再生。这种逆流再生柱的方法，不错救活大部分柱子。4、 注入色谱柱的溶剂、标液、样品溶液王人必须严格过滤，以去除杂质，防卫堵塞色谱柱。当用反冲洗方法无效时，可将柱口过滤安装取下，用弱酸溶液惩办，去除秽物或依期更换。5、 提出：为了保护色谱柱，幸免给分析带来不必要的吃力，请使用保护柱！1.流动相中含缓冲盐的最好崭新配制。2.流动相的水也最好用崭新的，而且要放在棕色瓶中。要紧密流动相中的磷酸盐与甲醇羼杂时要紧密其比例，否则可能异致磷酸析出，堵塞柱子。我以为对于柱子的保护除了加预柱，流动相和样品要过滤之外，很首要的一丝是实验后柱子冲洗.冲洗液应该按柱子的说明进行.我在责任中发现:盲目的使用冲洗液，即使冲洗的期间很长，柱子的寿命照旧很短.而字据柱子说明书中不同流动相使用不同的冲洗液进行冲洗，能使柱子的寿命延迟.在进行柱子的再生时亦然如斯.说说生手容易出错的地方！1、用完柱子后不冲柱子。2、用完柱子后两头没封口。3、堵柱子后不顾死活就反冲。4、只消柱效不够就要买新柱子，不看是否有扶植措施。5、流动相含有机相用水系膜过滤。6、片剂溶解离心后不外滤。7、PH随机定就运转冲柱子。8、拧柱子时使劲太猛，导致接口塞在柱口。上头的情况民众可否际遇过！"要紧密流动相中的磷酸盐与甲醇羼杂时要紧密其比例，否则可能异致磷酸析出，堵塞柱子。 "思请问有什么具体要求?"要紧密流动相中的磷酸盐与甲醇羼杂时要紧密其比例，否则可能异致磷酸析出，堵塞柱子。 "思请问有什么具体要求?其实最好的是参照色谱柱分娩厂家的推选有想象，别的意见只可当作平时的参考，作到冷暖自知！针对普通的反相柱的冲洗，就我教学来谈几点吧：一般要作念好一下几点：1.保证样品内尽可能的表示，具体方法：1.1过0.45um微孔滤膜；1.2有些样品很难滤过：我际遇过这种情况，我罗致的方法是将样品放雪柜静置1天，然后在过0.45um微孔滤膜，闭幕并不影响试验；2.等于具体进样的时候：中药的话一般最好罗致预柱；化药毋庸也行的；3.柱子的冲洗了：3.1如果流动相有盐或者离子对的话先用纯水冲洗30～60分钟的时势，然后从低浓度冲到高浓度，临了用甲醇饱和就ok了，期间一般在60～90分钟就行了 3.2如果流动相莫得盐或者离子对的话就平直从低浓度冲到高浓度，临了用甲醇饱和就ok了，期间一般在60～90分钟就行了。 4.就好多东说念主说：不要用纯水冲洗，我认为并不一定的，不错用水，但是不要罗致高流速这是的确，我的试验一直是罗致纯水的，闭幕莫得什么问题。我当今在作念一个新的化合物，用一般的C18柱分不开，但能稍许的看到是有两个峰，调流动相和流速王人分不开，我思换柱子，但不知说念用什么柱子好呢？shaoshen :离子对试剂是很难被“渐渐熔解在流动相中重干净”的吧？！它和C18之间的作用不成简便的相识为名义活性剂与C18的作用吧？！（唉～距离你的发言两年了～）xiaolan2148134 wrote:我当今在作念一个新的化合物，用一般的C18柱分不开，但能稍许的看到是有两个峰，调流动相和流速王人分不开，我思换柱子，但不知说念用什么柱子好呢？“一个化合物”还要跑出几个峰啊？作念破损实验吗？跑梯度了吗？我以为目下国内在分离度改善方面更多的是改换流动相，而国际更专注于遴荐柱子.我思可能是经费方面的问题吧.目下，Waters和安捷伦，HP有一系列针对不同物资和结构的柱子，提出遴荐其中一种多议论分析.我曾奏效地用普通C18柱在20分钟时辰离手性物资(流动相是甲醇-水体系)，是以际遇分离欠安不错接头字据结构选柱子，而非改流动相.具体的各公司网页和家具说明说中有.若柱子使用的期间较长，柱压较高时，可罗致柱子再生法惩办，即按水-甲醇-四氢呋喃-二氯甲烷-四氢呋喃-甲醇-水的纪律来冲洗柱子，以达到晋升柱子的柱效和寿命谢谢上头的，让我增长目力了色谱柱是液相色谱的腹黑部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的团员材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为1～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个预柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样。 柱效受柱表里因素影响，为使色谱柱达到最好效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床除外的死体积）及装填技巧。即使最好的装填技巧，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况老是不一样的，围聚管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这等于管壁效应。这种管壁区大要是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效交代柱效的影响远浩大于管壁效应。 2.1 液相色谱柱的结构 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等构成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70 kg/cm2时，也可罗致厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为晋升柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有东说念主在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以晋升内壁的光洁度，其成果与抛光疏导。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两头的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径取决于填料粒度，目的是防卫填料漏出。 柱接头罗致低死体积结构，柱接头是两头螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国表里已表率化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)一语气，中间放手压环用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的一语气管一语气，中间也放手压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm一语气管通过空腹螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空腹螺钉。压环被空腹螺钉挤压变形后紧箍在一语气管上(一语气管通过压环后显现的管长度应严格适度在2．5mm长或其他固定尺寸)。 在两头柱接头内，柱管两头各放手一派不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要紧密，柱及一语气管内不成永劫间存留此类溶剂，以幸免腐蚀。 2.2 色谱柱分类 色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同：①老例分析柱（常量柱），内径2～5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长 10 ～ 30cm；②窄径柱（narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn），内径1 ～ 2mm，柱长10 ～ 20cm；③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2 ～ 0.5mm；④半制备柱，内径＞5mm；⑤实验室制备柱，内径20 ～ 40mm，柱长10 ～ 30cm；⑥分娩制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是字据柱长、填料粒径和折合流速来细则，目的是为了幸免管壁效应。 2.4 柱的填充和性能评价 色谱柱的性能除了与固定相性能相关外，还与填充技巧相关。在正常条目下，填料粒度＞20μm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20μm时，湿法填充较为理思。填充方法一般有4种：①高压匀浆法，多用于分析柱和小限制制备柱的填充；②径向加压法，Waters专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技巧性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。必须指出，高效液相色谱柱的获取，装填技巧是首要枢纽，但根底问题还在于填料本人性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。不管是我方装填的照旧购买的色谱柱，使用前王人要对其性能进行覆按，使用期间或放手一段期间后也要重新检讨。柱性能成见包括在一定实验条目下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、表面塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和遴荐性因子的重迭性，或分离度。一般说来容量因子和遴荐性因子的重迭性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要紧密柱外效应是否有变化。一份及格的色谱柱评价陈诉应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不合称度和柱压降等。 2.5 柱的使用和爱戴紧密事项 色谱柱的正确使用和爱戴十分首要，稍有失慎就会禁止柱效、镌汰使用寿命以至损坏。在色谱操作经过中，需要紧密下列问题，以爱戴色谱柱。1　幸免压力和温度的急巨变化及任何机械转折。温度的倏得变化或者使色谱柱从高处掉下王人会影响柱内的填充景况；柱压的倏得升高或禁止也会冲动柱内填料，因此在退换流速时应该沉着进行，在阀进样时阀的动掸不成过缓（如前所述）。2　应渐渐改换溶剂的构成，独特是反相色谱中，不应平直从有机溶剂改换为全部是水，反之亦然，流动相使用前必须经脱气和过滤惩办3　一般说来色谱柱不成反冲，惟有分娩者指明该柱不错反冲时，才不错反冲除掉留在柱头的杂质。否则反冲会飞速禁止柱效。4　遴荐使用适合的流动相（尤其是pH），以幸免固定相被破损。有时不错在进样器前边一语气一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在参加分析柱之前事先被硅胶“饱和”，幸免分析柱中的硅胶基质被溶解，压力升高是需要更换预柱的信号。5　幸免将基质复杂的样品尤其是生物样品平直注入柱内，需要对样品进行预处 理或者在进样器和色谱柱之间一语气一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱不错而且应该时常更换。6　时常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂渐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍傍边，即老例分析需要50～75ml。7.幸免使用高粘度的溶剂当作流动相；如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验结束柱子冲洗干净8进样样品要提纯； 9严格适度进样量； 不要超载10 每天分析测定扫尾后，王人要用合乎的溶剂来清洗柱，最好用洗脱才略强的洗脱液冲洗，举例ODS柱宜用甲醇冲洗至基线均衡。当罗致盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管说念，不宜始终与之搏斗。装在HPLC仪上柱子如时常常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。11大多数反相色谱柱的pH结识边界是2－7.5，尽量不逾越该色谱柱的pH边界12 按说明书保存色谱柱，统统阻挠讲缓冲液留在柱内过夜，紧密反相柱不成用纯水永劫间冲13 不提出绝交柱子，我方更换填料 一般来说，总共的清洗方法王人有雷同的风物。所用的溶剂王人是随溶剂强度加多，时常临了一个溶剂瑕瑜常疏水的（如醋酸乙酯以至是烃），不错用来溶解非极性物资如脂质和油类。咱们必须保证一系列溶剂中每个溶剂王人能与下一个溶剂互混。清洗经过要扫尾时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。举例，异丙醇是一个至极好的当作中间设施的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度至极大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。诚然，如果使用紫外检测器的话，幸免溶剂在紫外区域有招揽，要否则需使用大王人的溶剂冲洗才气使基线安详。当拿到一根新色谱柱时，请搞先仔细阅读其说明书和质检陈诉，并按陈诉说明进行考证，以下参数必须明晰：填料类型（C18，3μm，全多孔型，含炭量，100A，）    色谱柱规格（250×4.6）柱子出厂保存在何种溶液，是否均衡过，否则需要在使用前以低流速均衡过夜 当色谱柱使用一段期间，柱效下落的很蛮横时请字据下表遴荐您的再生方法：极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→酒精→水**非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水0.05M稀硫酸不错用来清洗已羞耻的色谱柱在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的风物存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。 **如果简便的有机溶剂/水的惩办不成够完全洗去硅胶名义吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗至极灵验。 色谱柱永劫间毋庸，存放时，柱内应充满溶剂，两头封死（请按说明书的规则，罗致相应的溶剂。） 还有一个问题是清洗经过中是否不错把HPLC柱子反过来。因为大多数强保留的羞耻物王人会积贮在柱头，把柱子反过来不错镌汰羞耻物被冲出柱子的迁徙距离。接头到装填柱子的结识性，当今大多数HPLC柱子王人是比普通操作压力大好多的高压装填的，因此他们的柱床应该不会受到反地方流速的影响。但是，如果头上的烧结比尾部的烧结孔径大的话。举例尾部烧结的孔径是2μm，他往时能够留下平均5μm孔径里的填料。有时侯厂家会让头部孔径较大以幸免样品或流动相颗粒堵塞。如果这种孔径大于装填颗粒尺寸漫衍弧线的最小粒径时，有些填料能穿过这些漏洞而流出色谱柱，这么会导致空缺出现。如果柱子有箭头标记提出的流动地方，我提出通过操作手册和说明书，厂家主页或者技巧撑持部门等证据是否不错把柱子反过来冲。不管你是否把柱子反地方，最好不要让溶剂通过检测器幸免羞耻物和穿透漏洞的颗粒参加检测池，否则有可能引起羞耻。 对于反相柱子，不提出用名义活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）和三硝基甲苯，因为这些化合物势必会牢固吸附在硅胶键合相柱子上很难除掉。用名义活性剂会影响装填名义而改换其性质。 如果样品含有离子化合物，变化pH不错使他们转为非离子状态，这么他们就不错被水－有机溶剂羼杂物洗脱下来。举例，强碱性物资能在pH低于3时被除掉，在这个条目下质子铵变得水溶性更好。酸性物资能在pH养息到大于其pKa时被洗下来--大要时pH8或9，这个状态酸性物资处于离子状态。然而，要紧密硅胶柱子在永劫间处于高pH条目下容易被破损。色谱责任者时常会议论到离子对色谱中离子对试剂对固定相的影响。清楚离子对试剂如辛烷－磺酸（用于阳离子）和四烷基铵溴（用于阴离子）在一定浓度的有机修饰剂下能很强地吸附在硅胶键合柱子上。柱子因此被羞耻很难回复到肇始状态，因此东说念主们王人认为任何用于离子对的柱子王人会被破损而且用于不成再用于普通的反相色谱。 Bidlingmeyer不承诺这种不雅点，他认为用于离子对色谱尖酸的pH值和会过水解键合相和在酸性条目下（pH1-3）硬化硅胶或在高pH条目下（pH7-8）溶解硅胶使一些柱子的性质改换。要清除离子对试剂中的磺酸，他提出着手用疏导的莫得离子对的缓冲液（至少20体积）冲洗然后用莫得缓冲液的流动相(在清洗经过中甲醇可能比乙晴更灵验；如果是长链的离子对试剂，用四氢呋喃)。很昭彰，磺酸离子对试剂和铵离子对试剂有着不同的推崇。Bidlingmeyer和他的息争者诠释了在C18柱子上用流动相浓度大于70％的甲醇，长链离子对试剂，SDS不会吸附在固定相上。这个发现跟分离组的闭幕一致。硅胶键合举座柱如Chromolith 柱子（默克公司，德国）可认为跟别的硅胶柱一样。色谱柱中的流动相会排干吗？     不少作念色谱分离试验的东说念主际遇过这么的情形：失慎未实时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而罢手责任了。如斯情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中总共流动相王人排干了？色谱柱还能使用吗？ 事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会形成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只可输送液体，而不成输送空气。比较之下，另一个更可能发生的情况是健忘盖上色谱柱两头的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。相同，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能仅仅色谱柱两头的几个毫米变干了，因蒸发掉总共溶剂是色谱柱变干需要相当长的期间。即使色谱柱的确变干了，也不一定就暗示治不好的绝症了。不错尝试用一种完全脱气的、名义张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除掉气体。较低的名义张力有助于浸润填料名义；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除淹留在填料中的气体。色谱柱大要需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的期间被透顶浸润，复兴到正常状态。 既然谈柱子，那也谈谈填料固定相基质（担体） HPLC填料不错是陶瓷性质的无机物基质，也不错是有机团员物基质。无机物基质主若是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大，在溶剂中封闭易扩张。有机团员物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机团员物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗透有机基质中，导致填料颗粒扩张，闭幕减少传质，最终使柱效禁止。 硅胶 硅胶是HPLC填料中最深广的基质。除具有高强度外，还提供一个名义，不错通过闇练的硅烷化技巧键合上各式配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于世俗的极性和非极性溶剂。纰谬是在碱性水溶性流动相中不结识。往时，硅胶基质的填料推选的老例分析pH边界为2～8。硅胶的主要性能参数有：①平均粒渡过甚漫衍。②平均孔径过甚漫衍。与比名义积成反比。③比名义积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比名义积越大，溶质的k值越大。④含碳量及名义消散度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。⑤含水量及名义活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其名义硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。⑥端基封尾。在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。⑦几何体式。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价钱较低廉， 纰谬是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此纰谬。⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾 硅胶的名义结构名义积 硅胶的比名义积（每克硅胶的名义积）与孔径大小成反比。名义活性名义活性取决于硅胶名义含有的硅羟基。游离硅羟基：活性最高氢化硅羟基：活性有所禁止硅氧环：活性很弱活性的退换：在硅胶中加入一定量水，行使物理吸附水禁止活性。1.1.2 氧化铝 具有与硅胶疏导的致密物感性质，也能耐较大的pH边界。它亦然刚性的，不会在溶剂中减轻或扩张。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不结识。不外当今还是出现了在水相中结识的氧化铝键合相，并自满出优秀的pH结识性。1.1.3 团员物以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限制比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个pH边界内结识，不错用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质内容上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它不错通过合乎的功能基修饰变结婚水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也不错承受在pH13下反复冲洗。 总共团员物基质在流动相发生变化时王人会出现扩张或减轻。用于HPLC的高交联度团员物填料，其扩张和减轻要有闭幕。溶剂或小分子容易渗透团员物基质中，因为小分子在团员物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，是以形成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像卵白质或合成的高聚物，团员物基质的遵守比得上陶瓷性基质。因此，团员物基质世俗用于分离大分子物资。1. 1．4 基质的遴荐 硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，团员物填料用于大分子量的被分析物资，主要用来制要素子排阻和离子交换柱。  硅胶  氧化铝  苯乙烯-二乙烯苯  甲基丙烯酸酯耐有机溶剂  +++  +++  ++  ++适用pH边界  +  ++  +++  ++抗扩张/减轻  +++  +++  +  +耐压  +++  +++  ++  +名义化学性质  +++  +  ++  +++遵守  +++  ++  +  + 化学键合固定相将有机官能团通过化学响应共价键合到硅胶名义的游离羟基上而形成的固定绝顶为化学键合相。这类固定相的隆起特色是耐溶剂冲洗，况且不错通过改换键合相有机官能团的类型来改换分离的遴荐性。目下，化学键合相世俗罗致微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶名义的游离硅醇基响应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶名义的硅醇基密度约为5个/nm2，由于空间位阻效应（不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上）和其它因素的影响，使得大要有40～50%的硅醇基未响应。残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，独特是对非极性键合相，它不错减小键合相名义的疏水性，对极性溶质（独特是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的均衡速率放慢，禁止了键合相填料的结识性。闭幕使碱性组分的峰形拖尾）。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合响应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化惩办，称封端（或称封尾、封顶，end-capping），以晋升键合相的结识性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的“湿润”性能。由于不同分娩厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和响应条目不同，因此具有疏导键合基团的键合相，其名义有机官能团的键合量时时隔离很大，使其家具质能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(C%)来暗示，也不错用消散度来暗示。所谓消散度是指参与响应的硅醇基数量占硅胶名义硅醇基总额的比例。pH值对以硅胶为基质的键合相的结识性有很大的影响，一般来说，硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用。键合相的种类化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用作正相色谱，羼杂物在极性键合相上的分离主若是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。常用的非极性键合相主要有各式烷基(C1～C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离遴荐性王人有影响，一般来说，样品容量随烷基链长加多而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的遴荐性；但短链烷基键合相具有较高的消散度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。另外C18柱结识性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的起因，但C18基团空间体积较大，使灵验孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低。固定相的遴荐分离中等极性和极性较强的化合物可遴荐极性键合相。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的遴荐性。氨基键合相具有较强的氢键相聚才略，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离才略；氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生遴荐性相互作用，故被世俗用于糖类的分析，但它不成用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等，因为它们之间会发生响应生成Schiff 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和卵白质。分离非极性和极性较弱的化合物可遴荐非极性键合相。行使特殊的反相色谱技巧，举例反相离子扼制技巧和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为世俗的非极性键合相，它对各式类型的化合物王人有很强的顺应才略。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离，而苯基键合相适用于分离芳醇化合物。另外，好意思国药典对色谱法规则较严，它规则了柱的长度，填料的种类和粒度，填料分类也较详备，这么使色谱图易于重现；而中国药典仅规则填料种类，未规则柱的长度和粒度，这使历练东说念主员难于重实际验，在某些情况下还倏地期间和试剂。固定相的结构 50μm large porous particles大孔填料30μm2μm active surface pellicular beads名义多孔型薄壳玻璃珠3-10μmMicroparticulates全多孔型硅胶微粒填料50μm填料的纰谬：机械强度低，传质阻力大，柱效低30μm填料的纰谬：比名义积小，吸附不充分，分离度不好3－10μm填料最常使用如果名义硅羟基键合不完全，会有二次保留效应，使得峰形发生扩展，是以对闪现的硅羟基要推论封端（封尾）技巧。常见的封尾技巧：1.空间位阻：甲基换成异丁基2.双封端法：用C18和甲基同期封端3其他技巧在甲醇中，毛（C18 )处于建造状态，而在纯水中，毛处于瑟索，倒立状态，始终用纯水冲柱子，键合相容易挫伤，是以提出用5－10％甲醇的水溶液替代纯水洗柱子（缓冲盐） 当小孔径、端基封口致密的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生疏离倏得丧失及被分析物资保留昭彰禁止或完全不保留的气候，这等于疏水垮塌。此气候是由流动相不浸润固定相名义而致。扶植的办法达成用含大王人有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行均衡。由是色谱柱始终储存也会发生此气候。使用内嵌极性基团的反相色谱柱（如Waters SymmetryShield RP色谱柱）或非端基封口的色谱柱（如Waters Resolve色谱柱）也可幸免发生垮塌。 最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占总共柱填料的80％。它是通过化学响应把某种合乎的化学官能团（举例各式有机硅烷），键合到硅胶名义上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技巧中最首要的柱填料类型。 使用微粒硅胶要独特紧密它的使用pH边界是 2～7.5，若过碱（＞pH8），硅胶会龙套或溶解；若过酸（＜pH1），键合相的化学键会断裂。有些特殊的健合相不错用于pH 9～11。正相色谱旨趣极性固定相有机流动相传统硅胶氧化铝目下氰基氨基二醇基适用于同分异构体的分离在有机/水流动相中不溶化合物的分离适用于中等极性化合物的分离机理H键偶极矩П键溶质顶替等量的溶剂被分析物极性过大时，样品会在吸附柱中会被永恒的吸附保留，糟蹋柱子硅胶柱和氧化铝柱的纰谬：容易脱尾样品被催化明白不易剃度洗脱含水量要适度太多，贴不完，上头是我方三年前作念的PPT，成心先容液相，有1000多页，参考了好多课件，还有安捷伦网站，及液相方面册本，但是也有好多我方写的体会，造作不免，有些东西也存在争论，液相技巧发展很快，上头是三年前的，数据不准，民众见凉!小色尼姑庵